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PHDUHRF1识别未修饰状态的组蛋白H3R2参与常染色质基因的表达离调控

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内容提示: 摸*大博 士 学 位 论 文P H D uHRF I识别未修饰状态 的组蛋 白 H 3RZ参与常染色质基 因的表达调控生物 医学研 究 院生物化学与分子生物学系业院专姓名 : 汪 振 天指 导教 师 : 施扬教授石 雨江教授指导小组成 员施扬教授石雨江教授刁建波副教授蓝 斐研 究员完成 日期 : ZOn 年 7 月 7 日 目 录缩 写词部分. . . . . . . . . . . . . . . . … … , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...

文档格式:PDF| 浏览次数:55| 上传日期:2015-06-17 22:25:24| 文档星级:
摸*大博 士 学 位 论 文P H D uHRF I识别未修饰状态 的组蛋 白 H 3RZ参与常染色质基 因的表达调控生物 医学研 究 院生物化学与分子生物学系业院专姓名 : 汪 振 天指 导教 师 : 施扬教授石 雨江教授指导小组成 员施扬教授石雨江教授刁建波副教授蓝 斐研 究员完成 日期 : ZOn 年 7 月 7 日 目 录缩 写词部分. . . . . . . . . . . . . . . . … … , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … 1中文摘要. . . . . . . . . . . . . . . . … … , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … “ . … … ‘ .… , . . … …~~二 “ ~. . … … ” . . … ~ . . . … … , … , . . . . … … 2英文摘要. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … ‘ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … 3第一部分前言1.表观遗传学概况. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … 42.UHRFI 的研 究概况 . . . . . . . . . . . . . . . . … … , . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … 7第 二部分 UHRFI 的 PHD 结构域 识别 未修饰状 态 的组 蛋 白 H3RZ引言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … 。 . . . . … … n材料 与方法. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … 13结果. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … 27讨论 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . … … 。 . . . . . . . . . . . . . . . … … 41小结. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … 43第三部分PHD u HR F;识别未修饰 的组蛋 白多肤 H3RZ 对 UHRF I 调控 靶基 因的表达 具有 重要作用弓 !言. . . . . . . . . . . . . … … , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … “ . . …‘ … 。 . . .. …… , … , . … 44材料与方法. . .. . . . . . . . . . . . . . . . … … , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … 。 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … 46结果. . . . . . . . . . . . . . . . . … … , . . . . . . . . . . … … , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … , . . . . . … … , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … 69讨 论. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……。 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … …91小结. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. … …。 。 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … 94全 文 总结 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … … , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一 。 …。 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……95附录参考文献 . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . .. . .. . .. . .. . . . . .. . ……。 . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . .. . ……96己发 表 论 文致 谢 . . . . . . . . . … … 主要英文索引英 英 文缩写 写英文名称称中文名称称PP P C H HHPeri eentrom eri eheterochrom ati nnn外周 着丝粒 异 染色质质CC C h! P PPChrom ati oni m m unoPreci Pi tati onnn染色质 免疫 沉 淀淀HH H 3RZm eZa/s ssAsym m etri e /Sym m etri cal 一 m ethylargi neZZZ 组蛋 白 H3 第 2 位精氨 酸对 称///hhhh h i sto ne 333非对 称 甲级 化化HH H 3K4m e1Z加 加M ono一 /di //tri 一 m ethylI ysi ne4hi stone 333组 蛋 白 H 3 第 4 位赖 氨 酸 单/双///三三三 三 甲基化 化HH H 3Kgm e」 /劝 劝M ono一 /di //tri 一 m ethylI ysi ne9hi st one 333组 蛋 白 H3 第 9 位赖氨酸 单/双///三三三 三甲基 化 化HH H 3R8m eZa/s ssA sym m etri e /Sym m etri cal 一 m ethylargi nesss 组 蛋 白 H 3 第 8 位 精氨 酸 对 称 ///hhhh h i sto ne 333非对 称 甲级 化化HH H 3R17m eZa八 八A :ym m etr子 e /5ym m etri ea卜 m ethy} argi ne1777 组 蛋 白 H 3 第 17 位 精 氨 酸对 称 ///hhhh h i sto ne 333非 对 称 甲级 化化HH H 4 R3m eZa/s ssA sym m etri c /Sym m etri eal 一 m ethylargine333 组 蛋 白 H4 第 3 位 精氨 酸 对 称 ///hhhh h i sto ne 444非 对 称 甲级 化化HH H 4 K20m e 」 左 归 归M ono一 /di //tri 一 m ethyll ysi ne20hi stone 44 4组 蛋 白 H 3 第 20 位 赖氨 酸 单/双双////// / 三 甲基 化 化ll l PPP i m m unoPreeiPi tati onnn免 疫 沉 淀淀qq q PCR RRQ uanti tati vePC RRR定 量 PCRRRSS S h RN A AASho rthai ri nRN AAA短 发 夹 结构 RN AAAPP P H D DDPl anthom eodom ai nnn植物 同源结 构域域PP P H Du日 Rri iiPH Ddom al nofU H RFIIIU 日R 「 ,的植物 同源 结构域域G G G O O OG e n eo n to lo g yy yy yPP P ! !!ProPi di umi od i deee碘 化 丙 睫睫OO O D DDO Pti ealdensi tyyy光 密度度MM MeD 】 P PPM ethyl atedD N Alm m unoPreei Pi tati onnn甲基 化 O N A 免疫 沉 淀淀BB B SP PPBi sul fi te一 Seq uenei ngPC RRR亚 硫 酸 盐 测 序 中文摘要组蛋 白的精氨酸 (R) 和赖氨酸 (K) 可 以发生 甲基化 修饰 , 这些修饰在生 物体 内是一种 动态 的过程 ,具有重要 的生物 学功能 。UHRFI 的 SRA 结构域可 以识 别结合半 甲基化 的 DNA ,并招募 DNA 甲基转移酶 DNMTI , 以甲基化 的母链为模板在对应的新合成链进行 甲基化修饰 , 从而使母链 DNA 的 甲基 化修饰状 态完整地遗 传 给子代 DNA ,所 以具有重要 的生物 学 意义 。UHRFI 的其 它结 构域也具有很重要 的功能,本实验 中我们发现 UHRFI 的 PHD 结构域可 以特异性地识别结合 未修饰状态 的组蛋白 H3RZ,这种 结论基于我们 的多肤 结合 实验 (peptide binding) ,等温滴 定量热法实验 , 以及 洲RFI 的 PHD 结构域与组 蛋 白 H3 多肚 形 成 的复合物 晶体结 构 实验 。UHRFI 的 PHD 结构域可 以与未修饰状态 的 H3RZ 的肌 基形成广泛 的分子 间氢键作用 网络 ,H3 RZ 的 甲基化会破 坏 PH氏HR F;与 H3 多肤 形成 复合物 ,而 H3K4 及 H3 Kg 的甲基化 不会影 响这种作用或 者影 响非常微 小 。 我们通 过表达谱 芯片检测到 大量受UHRFI 调控 的基 因 ,并通 过 染 色 质免疫 共沉 淀 技 术检 测 到 UHRFI 直接 调控 的靶基因 。最重要 的是我们 发现 了 UHRFI 直接调控 的靶基 因 的表达依 赖于 UHRFI 的 PHD结构域识别 未修饰状态 的组 蛋 白 H3RZ ,由此揭示 了 PHDuHR F, 识 别 结合未修 饰状态的组蛋 白 H3RZ 在生物 功 能上 的重要性 ,同时表 明组 蛋 白精氨 酸 甲基化 与 UHRFI的功 能 间存 在可 能 的 串话 作 用 (Cro SStal k )。uHRF I,PHD 结构域 ,组 蛋 白 H3 ,精氨 酸残 基 , 甲基 化 ,基 因表达中图分类号: R3 A B S T R A C TH isto n em e th y lati o no ceu rso nb o thI y sjn ea n da rg in jn eresid u e san di tsdy nam i c regul ati o nPl aysaeri ti ealrol ei nchro m atinbi o l ogy.H erew eidenti fytheU H RFI PH Ddo m ai n (PH D u。 RFi), ani m Portantregul ato rofD N AC PGm ethyl ati o n, asan unanti ei Patedhi stoneH 3unm odi fi edarginine Z(H 3 RZ)一 reeogni ti o nm o dali ty.T hi seo n e l u si o n 1 5b ase do nb in d in gstu d i e sa n deo 一 e rysta lstru etu re so fth eP H DU H R FIb o u n d toh i sto n eH 3P e P tid e s, w h e reth eg u a n id in iu mg ro u Po fu n m o d i fie dR Zform sa n e xte n si v einte rm o le e u la rhy d ro g e nb o n dn e tw o rk,w i thm ethy la ti o no fH 3 R Z ,b u tn o t H 3 K 4o rH 3 K g ,d isru P tin geo m P l e xfo rm atio n . W eh a v ei d e n tjfi e dd jreetta 限e tg e n e s o fU H R F Ifro mm iero a rraya n dC h IPstu d ies. lm P o rta n tl y,w esh o wth atU H R F I , 5 a b ilitytore P re ssi tsd ire etta rg e tg e n ee x P ressio n1 5d e P e n d e n to nP H D U H R F I b in d in gtou n m o d i fie dH 3 R Z ,th e re b yd e m o n stratin gth efu n Ctio n a lim P o rta n ce o fth isre eo g n i tio nev e n ta n dsu P P o rtin gth ePo te n tia lfore ro ssta lkb e tw e e n h i sto n ea rg in in em ethy latio na n dU H R FIfu n eti o n .Ke 丫四O rds:U H R F I, P H D d o m a jn , h isto n eH 3 , a rgjn jn eresjd u e ,m e thy latio n , g e n ee xP re SSio n .中图分类号 : R3 第一部分 前 言1.表观遗传学概况自从孟德尔通过豌豆实验 ,发现 了遗传 规律 、分 离规律及 自由组合 规律 ,到2000 年人类基 因组计划(h。 m 。 n gen。 m eproj ect, 日 G。 )“ 工作框架 图 ”基本完成 ,20世 纪遗传 学领域 经历 了传 奇 、曲折和 富有成 果 的发展 ,同时也积 累 了许 多经 典遗传 学 不 能 解释 的遗 传 现 象 ,提 示 着 在 经 典 遗 传 学 之 外 需要新 的理 论 突破 。随着20 世 纪后期表观遗 传 学研 究领域取得 的一系列重大 进展 , 和近年来 使用各种生物 学手段进行 的深入研 究 , 这 一新 的遗传 学分支 日益 受到关注 ,目前 己成为生物学 的重要研 究领 域 。1.1 表观遗传学概念 的发展“ 表 观遗传 学 , , (epigeneties) 最初 提 出于 1939 年 , waddington 首先在 《 现代遗传 学 导论 》 中使用 了这一术 语 。1942 年开 始他把表 观遗传 学描述 为一个 控制从基 因型到表 现型的生物学机 制 〔 ‘ 〕 。“ 表观遗传 学 ”是与 “ 遗 传学 ”相对应 的概 念 ,这 个概 念 随着 人们对进 化 生物 学 ,发 育生 物 学 ,分 子生物 学 的研 究逐 渐 发展 完善 。在 20 世 纪后期表观遗传 学 的概念得 到迅 速 发展 ,1987 年 ,Hollidy 对表 观遗传 学进行 了较为 系统的描述 , 指 出可在 两个 层 面上研 究高等生物 的基 因属性 :第 一个层面是基 因的世代 间传 递 的规律 , 这就 是我们 所熟知 的经典遗传 学 ;第 二个层 面是生 物从受精卵到成 体 的发 育过程 中基 因活性变化 的模 式 , 这是表观遗 传学 〔 , , 。此 时这个 概念还 限定在 生物体细胞 系发 育分化 的过程 中 。随着 实验数据 的积 累 ,人们对生物体 内部 分子机制 的研 究深 入 ,到 了 1994 年 ,Hol lidy 又指 出, 基 因表 达活 性 的变化 不 仅发 生在 发 育过程 中, 而且 也发生 在生物 体 己分化的细胞 中 ; 基 因表达 的某种变化 可通过有丝分 裂 的细 胞遗传 下去 。他进 一步指 出表 观遗 传 学研 究 的是 “ 上 代 向下代 传递 的信 息 , 而 不 是 DNA 序 列 本 身 ”, 是 一 种“ 不 以 DNA 序列 的改变 为基础 的细胞核遗传 ”〔 3] ,这个 时候 的表 观遗传 学概念 己经 比较丰 满 。20 世 纪 90 年代 ,遗传 学研 究取得 巨大进 展 ,Wolffe 等 系列研 究 了组 蛋 白修 饰 , 确立 了染色质在 基 因表达调控 中的重 要作 用 , 到 了 1999 年 , wol lfe把 表观遗 传学定义为研 究没有 DNA 序 列变化 的 ,可遗传 的基 因表达 的改变 。这个 定义不仅可反 映表遗传学研 究的核心 内容 ,同时该定义 的包容性较大 ,不仅 包括 常见 的细胞核 表观遗传 ,还 可包括 已有报 告 的细 胞质表遗传现 象 〔 4]。而在 2004年 Allis 等编 著 的 《 表观遗传 学 》书 中可 以找 到两种 定义 , 一 种 定义 是表观 遗传 是与 DNA 突变无 关 的可遗传 的表 型变化 ; 另 一种 定 义 是 染色质调节 的基 因转录 水平 的变 化 , 这种 变 化 不涉 及 DNA 序 列 的 改变 。 无 论是 Wol 1fe 的概念还 是 Al115 等 人 的概念 , 目前 人们普遍 能接 受这 样 的描述 : 表观遗传 学就是研 究基 因的核昔酸 序 列不发生变化 的情况 下 ,基 因表达 可遗传 变化 的一 门遗传学 分支科 学 〔 5]。表观 遗传 学 的定义从 20 世 纪初 期 到现 在随着生物 学 的发展不停地变化 与修正 。但 不 管其 定义 怎么变化 ,现代表 观遗传 学 的数 据 和 理论 都在 逐 步积 累和 完 善 。1.2 表观遗传学的研究内容近年来表观遗传 学 的很 多研究工作都集 中在染色质修饰上 , 染色质修饰调节许 多 生物 学过 程 , 比如基 因表 达 ,细胞 周 期 ,凋亡 ,衰 老等等 。主 要 内容包括DNA 甲基化 修饰 ,核 内小分子 RNA ,X 染 色体 失活 ,基 因组 印记 ,逆转录病毒 因子沉 默 以及 目前研 究非 常 热 门的组 蛋 白转 录后 修饰 等 。与本 论文 结 合紧密 的是DNA 甲基 化 以及组 蛋 白的转录 后修 饰这两个 方面 ,所 以我们介绍 的重 点主要在这两个 方面 。1.2.1 DNA 甲基化作用DNA 甲基化是表观遗传 学研究 的一个重要领域 。 在 甲基 转移酶 的催化下 , DNA的 CpG 两个 核普 酸 的胞 嚓咤被选择 性地 添加 甲基基 团的化 学修饰现 象 。 通 常 发生在 5 ‘胞 嚓 淀位置 上 〔 6 1,具有 调节基 因表 达和 保护 DNA 该位 点不受特 定限制 酶降解 的作用 以及 帮助 形成特 定 的染色质 结 构 。DNA 甲基 化状态 的改变 可 导致 基 因结构和 功 能异 常 。人们 很早就开 始 了 DNA 共价 修饰研 究 ,但 很久 以后 才发现 DNA甲基化 的生 物 学作 用 。1969 年 Gri ffith 和 Mah ler 提 出 DNA 碱基 的共价修 饰可以调 节 基 因表 达 〔 7 , 。生 物体 通 过 DNA 甲基化 进 行 许 多重 要 的生物 学过程 , 比如 控制基 因的表 达 、维护染 色体 的完整 性 ,调节 DNA 重 组 的某 些环节 。DNA 甲基 化研 究 最 多的是 其调控基 因 的表 达 ,DNA 甲基 化在 多数 情况 下对基 因的转 录 、表达 起沉 默 作用 ,虽然目前 已经发 现基 因启动子 区域 的 DN A 甲基化 并不一 定 引起 基 因表 达 上 的沉 默或者 降低 〔 8] ,但 作为 调节 基 因表 达 的一种模 式 ,DNA 甲基 化一直 是研 究 的热 点 。关于 DNA 甲基 化参 与基 因表达 调控 的分子 机 理 , 目前主要有 两种假 说 : 一种 是直接模 型 ,即转 录 因子 因不 能识 别含 smc 的序 列而不 能与相 应 的转 录元件 结合 〔 9了 。这是 因为胞 嚓陡发生 甲基化 以后 ,DNA 链 上 的大沟会 有 构 象 的改变 ,这种 构 象的变 化会 阻碍 或 改变 转录 因子 与 DNA 的结合 ,从 而 阻碍 转 录 的起 始 (甲基化 并 不妨碍转 录 的延 伸 )。 比如转 录 因子 EZF 在 其 同源 结合位 点发生 甲基 化 以后就 无 法结合 到靶 位 点上 〔 l0 ]。另外 ,DNA甲基 化 还可 能直接抑 制 RNA 聚合酶活 性而抑 制 基因 的表达 。另一种 是 间接模 型 ,它包 括两 种 类 型 : 甲基化 DNA 与 甲基 化 DNA 结 合蛋 白结合 〔 ‘ ’ 一 ‘ 4] ; DNA 甲基化 改变染色 质结构 。两种情况都间接 阻碍转录 因子与DNA 结合而抑制转录 。此外 ,在许多编码基 因的启动子和第一个外显子序 列 ,常常有成簇 的 CPG 二核普酸对 ,被称 为 CPG 岛 。一般 生物体 内管家基 因的启动子CpG 岛中的胞 嗯咤并不 甲基化 ,以保持 这些基 因处于活化状态 。CpG 岛的功能与启动子 效 能紧密相 关 ,且 常常是复制 的起 点 。CpG 岛 中胞 嚓咤 甲基化 也是 调控 基因表达 的方式 之 一 。一般 认为在 肿瘤 发生 过程 中抑癌 基 因的启 动 子 区域 的 CpG岛会 发生 高 甲基化 ,而 原 癌基 因则会 发生 低 甲基化 。而 在某 些癌 症 当 中会发现CpG 岛没有 甲基化 的改变 ,反而是在 CpG 岛附近 的区域称作 “ CPG 岛岸 ”的位置会发生 甲基化 的改变 〔 ‘ 创。所 以如 同 cpG 岛发生 甲基化是调控基 因表达 的一种方式 ,“ CPG岛岸 ”的 甲基化 的改变 也 是调节基 因表达 的一种 方 式 。DNA 的 甲基化需要 甲基转移酶 的催化作用 ,DNA甲基转移酶按照合成 甲基化DNA 的模 式可 以分为两种 :一种是 以原有 的 甲基 化 DNA 链 为模板 , 在 新合成 的 DNA链 上进 行 甲基 化合成反应 (。 NM TI ) 〔 16 一 ‘ 7] ,一种 是没有模板 的全新 甲基 化合成(D N M T3a ,D N M 下 3b)〔 ’ 8〕 。1 .2.2 组蛋 白转录后修饰作用组蛋 白转录后修饰是表观遗传学研 究的一个重要领域 , 染色质一级结构是 由核小体在 组蛋 白 H1 的介导下彼此连接 形成 直径 约 10二 的串珠 结构 , 而每个核小体 则是 由大 约 ZOObp 的 DNA 超螺旋和 一个 组 蛋 白八 聚体 以及 一个分子 的组蛋 白H1 组成 「 , 9 〕 。到 目前为 止 ,人们还 不清 楚染 色 质 上 的修 饰 以及 染色 质 折 叠 组装 的高级结构在分裂 过程 中是 怎么传递 到子代 细胞 的 。组蛋 白上遍 布转录 后修 饰 ,这些修饰具有各种各样 的功能〔 ‘ 9] ,被认为携带 了重要 的表观遗传 学信 息〔 20 ]。1964 年 Al lfrey 等人首 次报道 了组蛋 白的 乙酞化修饰 ,至此组 蛋 白可 以经历转录后修饰这种生物 学现象被发现 〔 2‘ 〕 , 随后 的几十年各种各样 的组 蛋 白修饰被发现 ,包括 磷酸化 ,泛 素化 ,甲基化 ,类泛 素化等 。这 些修饰在 染色质 结构 ,基因表达等方面起 到 了非常重要 的作用 。 而组蛋 白修饰到底是怎么样影 响到染色质的结构 的,结构生物 学 的研 究提供 了证 据 〔 22 j,这种 结构生物学 的证据 使人们 了解到组蛋 白很 多修饰位于其 N一 端可 以 自由活动 的突 出于其核小体 结构 的尾 巴上 ,这种结构使得这 些修饰 可 以与周 围临近 的核小体相 互 作用 , 而 这种相 互作 用就有可 能提供 了一种 核小体 间相 互作用 的机 制 ,从 而影 响到整体 的染色质 结构 。同时组 蛋 白的各种 修 饰 ,可 以提供 一种 招募 核 蛋 白的信 号 ,这 些核 蛋 白包 括 一 些可 以利用 ATP 提供 能量重 塑染色质 结构 的酶类 ,比如 : sMA RcADI 〔 23 〕 ; 同时这 些核 蛋 白也包括 一些组 蛋 白修饰 识别 因子 , 这些 因子通 过识 别特 定 的修饰 可 以提供 某种特定 的生物 学信 号从而调节 DNA 的修 饰 状态 或者 染 色质 结构 以及 招募 一 些转录 调 节 因子 等 来 发 挥基 因调 节 的作用 〔 川。类 似 于 基 因密码子 的概念 ,不 同的碱基 组合可 以翻 译成 不 同的氨基 酸 ,2000 年 Da vi d Al liS 等提 出 了 “ 组蛋 白密码 ”的概念 〔 25 〕 ,其 认为 组蛋 白尾 巴上 的修饰是一种 组 蛋 白语 言,这种语 言 由某 些 蛋 白或者蛋 白结构域来 识别 翻译 ,从而传 递 出各种 生物 学信号 。从 发 现 组 蛋 白转 录 后 修 饰 现 象 到今 天 , 已经 有 大量 的 组 蛋 白密 码 识 别 子(Reader)被 发 现 ,包 括 某 些特 定 的蛋 白 ,蛋 白结 构域 等 。这 些 蛋 白结构域 包 括pw w P, Tudor,Chro m o, Brom o 以及 p日。结构域 〔 2 6 〕 。这些识 别子 通过 识 别 组蛋 白密码 从 而调控 一 系列基 于 DNA 序 列 的生物 学过程 ,包括基 因表 达调控 ,DNA 复制,以及 基 因重组 等 。组 蛋 白甲基化是组 蛋 白修饰研 究 中一个重 要领域 ,2004 年 Yan g Shi 实验室首次发 现 了组 蛋 白去 甲基 化酶 LSDI 〔 6, , ,从此将人 们 的 目光 带入 了一个新 的领域 ,并对 几十年来 组蛋 白去 甲基化酶 是否存 在 的争论 来 了一个 精彩 的了断 。 随后 大量的赖 氨酸去 甲基化 酶不 断地被 发现 , 同时组 蛋 白精氨酸去 甲基化酶 也在不 断地寻找 中 。在搜 寻 组蛋 白去 甲基化 酶 的过 程 中 ,人们也在不 断地搜 寻组 蛋 白甲基化位点 的识别子 。目前 人们 发现 甲基 化修饰 的组蛋 白或 者未修饰 的组蛋 白可 以由特定蛋 白的结构域 识别 并产 生相应 的生物 学 效应 , 比如调节基 因的表达 〔 26〕 ,但 是 目前人们 不清 楚地 是精 氨酸 甲基化 是如何 识 别 与调控 的, 精氨 酸 甲基化 修饰与赖 氨酸甲基 化修饰具 有 同等重 要 的作用 〔 27 ]。另外 ,人 们对 赖 氨酸 甲基转移 酶 以及 去 甲基化酶 已经研 究 的很清 楚 ,但 是对 精氨 酸 去 甲基化 酶 的研 究一直没什 么进展 ,对精氨酸 识别 因子 的研 究也处于初级 阶段 , 精氨酸 甲基化参与 了生物体 内各种重要 的生物 学过程 , 所 以寻找精氨 酸 去 甲基 化酶 以及 它 的识 别 因子 是现在 非常重要 的一个研 究方 向 。2.UHRFI 研究概况人 们 首 先在 小 鼠中发现 了 UHR FI 同源 物 ,自从 发现其与 DNA 甲基 化可 能存在紧密 的联系 之后 ,对 其 的研 究一直是 表观 遗传 学领域 的热 点 ,其包 含独特 的结构域 ,参 与 了组 蛋 白修饰 作用 以及 DNA 甲基 化作用 。参 与生物 体 内一 系 列重要 的生物 学 过 程 ,与肿瘤发生 亦紧密相 连 。2.1 研IRFI 的发现鼠类 的 UHRFI 同源 物 于 1 998 年 在 小 鼠组 织 中发现 ,存 在于细 胞 核 内,因为其分 子量在 95kd ,故命名为 NP95。随后 人类 中的 NP95 同源 物被 发 现 ,并命 名为工 eBPgo (s nverted e以 灯 box b一 ndi ng proteinof90koa)〔 28 一 2 , 〕 。这 之后 人 们开 始 使用UHRF 来命 名相 关 家族 的基 因 ,因为 NP95 和 工 CBP90 是最初 发现 的 UHRF 家族 的基 因,所 以其表达基 因被命名为 UH RFI 。 整个 家族 的蛋 白具有一个独特 的 SRA 结构域 (SET+R工 NG ) , 这个结构域仅存在于 UHRF 基 因家族 。在发现初期 ,UHRFI 的功能研 究主要集 中在细胞增殖 , 其在细 胞 内的时空定位 以及可 能 的基 因表达 调 控方面 。1998 年 Fuj imor i等人首次用 免疫组 化 的方 式在 小 鼠胸 腺细胞 中检 测 到NP9 5 特异性地表达 于 S 期 ; 而在 小 鼠淋 巴细 胞 中 NP95 在整个细胞周期 过程 中全部处于高表达状态 ,并且 NP95 的表达 具有组 织特异性 〔 28 ],这些结果表 明 UH RFI参 与 了细胞周 期 进 程 并有 可 能参 与 了 DNA 复 制 的过 程 。2.2 UHI咨l 与 DNA 甲基化及组蛋 白修饰uHRFI 包含 多种结构域 (u BI , T udor,p日 。 , sRA , R一 N G ), 这些结构 域 具有 不 同的功能 。Tudor 使 UHRFI 可 以识别结合 甲基化 的 H3Kg (H3Kgme3) , 这将 UHRFI 与 组蛋白联系在 了一起 〔 30 ];同时 UHRFI 的 SRA 结构域 己经从 晶体结构 的水 平解 析 出其可以与 DNA 链相 结合 ,从而将 uHRFI 与 DNA 的功能联 系起来[3 1一 32 1。结合 己有 的研 究信 息 ,UHRFI 主 要参 与 了细胞增 殖调控 以及表 观调控这 两个方面 。在 真核生物 中 , DNA 甲基化 具有 重 要 的生 物 学 意 义 , 表 现在 控 制基 因 的表达 ,维护染色体 的完整 性 ,调节 DNA 重组 的某些 环节 。一旦细胞发生分化 ,细胞 必须保持它们通过分化 获得 的表观修饰 ,将 这些表观 模 式完 整地传递 到子代 细胞 ,从而将母代 的表观遗传 信 息传递 到下一代 , 这对 子代 细胞 的正常功 能与存 活是 必须的 。而 uHRFI 则起 到 了保 留传递母代 DNA 甲基化信 息的功 能〔 31 一 32] 。这种 传递 是完全忠实于母本信 息 ,而一旦表观信 息遗传发生错误就有可 能导致严重后 果 。比如基 因印记基 因 的 甲基 化 模 式 一旦 发生变 化 就 会 导致 癌症 的发生 。UHRFI 所 指 导 的半 甲基化 DNA 的甲基化 复 制 与 DNA 甲基转移酶 的功 能密 不 可分 ,因为 UHRFI 本 身并没有 甲基转移 酶 的活 性 。 目前 ,在 真核生物 中发现 了 3类 DNA 甲基转移 酶 (D nm tl、Dnm tZ、D nm t3a、D nm t3b)。Dnmtl 一种 是 维持 性 甲基化酶 ,在 DNA 复制 完成 或者 DNA 损伤修 复 过程 中,DN MTI 可 以甲基 化 半 甲基化状态 的 DNA 链 ,所 以 UHRFI 在 DNA 甲基化 的表 观 遗传 中起 到 了重要作用 。之 前 的研 究认 为 应 该 有 一 个 DN A 复 制 复 合 体 中 的 因 子 可 以结 合 DN MT I,从 而 将 DN MTI 引导到复制位 点处 ,然后 进行 DNA 的 甲基化 保 留复制 。 PCNA 是 DNA 复制 复合 体 中一个关键蛋 白,其 与 DN MTI 间存在相互作用 ,但 研 究发现 PCNA 并没有 起 到 引导DNMT I 进 行 DNA 甲基化 复制 的功 能 。2004 年 MotokoUnoki 等人通过 EMSA 实验发现 uHRF I 的 SRA 结构域 可 以识别 甲基化 的 CpG[33 ), 2007 年 Jaf ar Shar if 和Ma gn。 lia Bo stick 等人 发现 了 UHRFI 通过其 SRA 结构域 识别半 甲基化 的 DNA 序列位 点〔 3, 一 32 ],并 引导 DNMTI 定位 到这 些 DNA 序 列位 置 进 行 甲基 化 的合 成 ,从 而 完成 了 DNA 甲基化 的表观 遗传 过程 (图 1) 〔 34 ], 由此 DNA 甲基化遗传 到子 代 的生物 学机 制 得 到 了进 一 步 的揭 示 。目前 已经 证 明 UHRFI 与 DNMTI 的 相 互 作 用 是一 种 直接 的相 互 作 用 ,一 篇 文 章 报道 相 互 作 用 的 区域 包含 SRA结 构 域 ,一 篇认 为 包 含PHD 结 构 域 「 拟后 一 旅, 如 果 从 DNMTI 考 虑 ,至 少 有 三 个 区域 是 包 含在 内的 l一 446aa,40 1一 615aa, 108 1一 14O8aa〔 : ‘ 2 · , 5 。2008 年 Ar ita K 等 人解 析 了 sRA一 DNA复合 物 的结构 , 指 出 UHRFI 的 SRA 结构 域 可 以通 过其 非 常保 守 的氨 基酸 形 成 一个 带有 凹面的球 状 结 构 ,SRA 识 别 结 合 半 甲基 化 的位 点后 ,半 甲基 化 位 点 的位 置 甲基化 的胞嚓 咙 可 以从 DNA 螺 旋 中翻 转 出来 结 合 于 球 状 凹面 的 口袋 里 主 侧。图 1 DNA 半 保 留复制过程 中 DNMTI一 UHRFI 形 成 的复合 体 。(用 绿 色 串联球 形 代 表UH RF I 的五 个 结 构 域 )。除 了通 过 SRA 结构 域 识别 半 甲基 化 的 DNA 以外 ,Ur HRFI 的 Tudor 结 构域 可 以识 别 结合 H3Kgme3二 30 ]。H3Kg 甲基 化 修 饰 是 细 胞 中广 泛 存 在 的一 种 组 蛋 白修 饰 模式 ,通 常 与 基 因转 录 抑 制 及异 染 色 质 形 成 有 关 ,在 小 鼠 M H3T3 以及 ES 细 胞 中可以观 察 到 H3Kg 在 异 染 色质 中心表达量 极 高 ,形成 明亮 的点状 区域 ,如 果用 DAPI染 核 ,可 以观 察 到这 些 点与 DAPI 所 处 的位置 重合 。 目前 发现 可 以催 化 H3Kg 发生 甲基 化 的酶 主 要 有 : SUV39H I/2, Gga, ESET/SETDB I 及EuHMTase/GLP 。可 以和 甲基化 H3Kg 结合 的蛋 白除 了 UHRFI 之 外还有 HP I (Heteroehromatin bindingprotein l) 。 UHRFI 中除 了其 Tudor 结构域 识 别 H3Kgme3 , 最近 也有报 道称 UHRFI可 以通 过 PHD doma in 结 合 H3KgmeZ/3, 并 招 募 Gga 和 HDAcl 使 p2 1 表 达 下调 仁 38」 ,当然 因为 目前没 有 更 多 的实验证 实 ,这个 结 果 目前有 待进 一 步验 证 。2.3 [J H RFI 与疾病 ,洲RFI 的 PHD 结构域潜在 的疾病相关性随着 研 究 的深入 ,UHRFI 被 认 为 是 一 个 原 癌基 因 ,在 各 种 各 样 的肿 瘤 中 ,uHRFI的表 达 都 有 升 高 的趋 势 , 比如 膀肤 癌 ,乳 腺癌 ,肺 癌 ,非一 腺癌 等 t 绷。在子 宫颈癌 中 UHRFI 的表 达水 平 被作为 一个 肿瘤 分期 的分 子 标 记 t 生 ’ 二 ;另有文 献报道 可 以用 uHRFI 作为 诊断 区分胰腺 癌 ,慢性胰腺 炎和正 常胰 腺 的一个分子 标记 〔 42 ];同样在膀肤癌 中 uHRFI 的表达水平与肿瘤发展程度有直接相关的关系〔 ‘ 3] 。 这些结果都说 明 UHRFI 有作为某些肿瘤诊断分子新型标记物 的潜 能 。UH RF I 的 PHD 结构域 的功能 目前研 究的不是很深入 ,其具体有什么功能还处于初级探索 中 , 之 前 的报 道指 出其可 能参 与 了外周着丝粒异染色质 区域 的一些结构形成 的功能,其是否参与了组蛋 白修饰 的识别等依 旧有待于深入研究 。而 PHD结构域作为一种经典的锌指结构 ,其参与 了各种各样 的生物学过程 , 与疾病发生等紧密相关 ,目前 己经有大量报道证实许 多包含 PHD 结构域 的蛋 白, 一旦它们 的PHD 结构域发生突变就会 导致各种疾病 (Tab 1e l) 「 阔。由于 UHRFI 与肿瘤 的紧密相关性,这使得我们将 目光集 中在其 PHD 结构域上 ,深入 的研究其 PHD 结构的可能的功能 ,极有可能为我们提供 UHRFI 参与疾病发生的分子生物学机制 。衍介 i no晚ase ass优认 ti onPHO 6n,r妞 比 即! a‘ onLi 吕 an舀 forPHD 石 n罗rIm m u n亡d 污。 记己 r s以 C Z川 R EG 七 r耐 in e m u 饱ti o nsH 3 K 4m 之 3C 是 r司 i ne m utat i 的 s 叹 bo t hPH D s)H 3K 4m e O《 州 0 1}U nk n洲 n (川 D Z)臼 n 仁 e r州‘1So m 日 t i c m Ut a t i m出 哄 m e3 . 2笋RID IA (RBPZ)阳 日 3N SD I.N SD 3M M S盯 〔 N S咙 )陡 L阳 F lT -B一 N 冷 Se ve记 C Om b i n 树 lm m u n记 e6仁 记n以《 scl D }and o 附 nn s扣drom e彻 toinU n unePoly endac r inOPat句 。ndi d伯 51,赶 。侧 仁 r阳 1au旧m(八 咚。 1) dy sr哪 h梦(A PE CE D), al 扣 k n洲 nunePo叭 l andula r‘ 扣drom 之 叩 已1asB犯a, r口n£ er ’ 服 切n。 帕 .esOPh日 即 a!翔u二 m 训 ‘比1M 界 loi d 她u 晚 m i a 1o rd no阳 (SSC ).he己 dandne仁 k s丈M 界 l o id l e u 幼m 扭M 炸 !o i d 沁u 晚 m 谙T -e.! 1 I y m P ho b! ast i e 绝u k a把 h aa臼 d o m et r ia!St t OI T 日!铂rc om aT r a n SI O C a ti 朋 o ft he t hi时 P H D J丁 口n ‘ !O C砚 南 nT 口n, lo cat i o n o fP HD 6 n界 rs伯 ns!o cat i 皿 o f州 D 6n梦 rsI n饱rn a!d 把 贻ti 翻 O ff i rstP H DT r刁 n s!优 ah o nU nk n洲 n (PH D 3》t I n 知 绷 nU nh aOW nU n 喻 。 w nU nkn 姗 nU n k nOW nN eum l o日。Id岳 写 。 州硬 rsN SD IC h ild h O Od o v e rg 旧 ‘thsy n d ro订比s 和 c hasSO t ., 即 d n笼 ” 仁a nd w 之 av er s卯 d m 砒V ariousx .lin缺d m en 比!佗t a 旧ad on d 加 吐er乐i 成 lu d in g A JP ha而 a肠s、 em 扭 朗 d M e nt a !肋t a 记at j on, x .! i n晚d 亡 产 丁 RX )Sy ndm 舰Rub ens比i n .T翻 ybiSynd r o 服 【 民 TS)B州 ”。 n一 FO r “而 n一 比hmann Syndra口 佬(B「 LS资C e rm l in em u t a ti o n sin 己 !】 5P H D s:灯u n c ati的 二 n” 仁 .侧 e l已 tio nG扭 r mli n. m u t a no ns(, 26 dis t i nctPH Dm u「 arion, 佗Po r 馆d ) U n k no w nU n 阮 Ow nC 吧 rm !in eC任 rm li ne m u t a ti o nm utat i ons(PH D lon珍}U n 腼 O 济 )nU n k now n撇C B P服殆 b l e l. M uta tio n s ing en e se n eo d in gP H D6 n ge rP ro te in sarea sso ei ate d 州 thaw id eva rietyo fh U m 己 n d i犯 a se S总之 UHRFI 是 生物 体 内非常关键 的一个 蛋 白, 参 与 了生物体 内各种 各样 的生物 学过程 ,包 括基 因调控 ,细胞凋亡 ,生 物体 发育 ,肿瘤发生 以及 非 常关键 的DNA 甲基化 的保 留复制遗传过程 。对其 进行 的研 究将 有助于人们对 生物 体各种生命过程 的理解 ,并有助 于将来 的肿瘤诊 断 以及 新 药开 发等 。 第二部分班巧 田 1 的 PHI ) 结构域识别未修饰状态的组蛋白H3 RZ胃 盯7 1心纷目表观遗传学的研 究是一个 热点领域 , 越来越 多 的人认识到除 了编码遗传信 息的 DNA 序列之外, 表观修饰也是一种 同等重要的生物学现象 。 表观遗传调控 的方式大致可 以分为四类 : DNA 甲基化 ,组蛋 白共价修饰,非编码 RNA 以及染色质重塑复合体 。真核生物 中染色质上 的组蛋 白存在各种 各样 的修饰 ,包括磷酸化 ,泛素化 ,乙酞化 ,甲基化等 ,它们可 以存在于组蛋 白的 内部或者处于相对 自由状态的尾 巴上。 这些修饰有可能影响了染色质的空间结构等, 从而影响了一些效应分子与染色质之 间的相互作用 ,由此调节 了各种各样 的生物学过程 ,比如基 因的转录调控 。这些组蛋 白修饰标记可 以由各种各样 的分子结构域识别解码 ,比如 PHD结构域 ,Brom。结构域 ,P姗P 结构域 ,Tudor 结构域 ,Chrom。结构域等,从而将这种表观遗传 学的标记信 息传 递 出去 ,导致不 同的生物学效应 。近年来组蛋 白甲基化修饰 的重要性逐渐被人们所认识 ,在这种基础上 ,结合磷酸化 ,泛素化 ,乙酞 化 等 ,David AlliS 等 人 于 2000 年 提 出 了组 蛋 白密码 子 的概念 (Histoneeode)「 25 」 。随着一系列 阅读 “ hist。 ne code”的效应分子 的发现 (HIStoneeodereader ),寻找 “ HIStone eodereader ”成为一个研 究热点 。1998 年 鼠类 UHRFI 的同源物 NP95 发现 ,到 2000 年人类 中的 UHRFI 同源物ICBp90 (Inverted eeAATboxbindingpr。 teinof90koa ) 被发现 〔 , ‘ 1 2 , 〕 ,这个蛋 白包含 UBQ,Tudor ,PHD,SRA ,RING 五种结构域 ,这五种结构域 中 目前 PHD结构域 的功能研究很少 ,最初人们认为 UHRFI 的 PHD 结构域可能是帮助 UHRFI识别结合 DNA ,但是后来 的证据表 明其功能可能并非如此 ,因为越来越多 的证据表 明是 UHRFI 中的 S以 结构域参与了 DNA 的结合 。2008 年 《 自然》杂志上的两篇结构类 的文 章最终证 明了 sRA 结构域识别结合半 甲基化 的 DNA 链 〔 呱6 3, ,从而使得 DNA 复制过程 中可 以将母链 DNA 甲基化修饰状态完整地遗传给子代 DNA 。关于uHRFI 的 PHD 结构域 ,目前仅有一篇文献报道 了其参与外周着丝粒异染色质 区域(peri eentrom eri e heteroehrom ati n, pe日) 的结构形成 ,一旦 uHRFI 的 pHD 结构域缺 失 ,NJH3T3 细胞 中 PCH 的形态将发生变化「 44 1; 另有一篇文献报道 UHRFI 的 PHD结构域可 以识别结合 H3Kgme 3,一旦 UHRFI 的 PHD 结构域缺 失 ,UHRFI 将无法定位 在 N工 H3T3 细胞 的 PCH 区域 〔 45 J。但 是 随着研 究 的深入进 行 ,矛盾 的观 点与数据逐渐 出现 ,2008 年人们发现 UHRFI 中的 Tudor 结构域负 责识别结合 H3Kgme3, 于是人们对 UHRFI 的 PHD 结构域识别结 合 H3Kgme3 将 UHRFI 定位在 PCH 区域这个观 点提 出 了疑 问‘ 。除 了参 与 PCH 结构 的调节 以外 ,UHRFI 的 PHD 结构 域还有什 么功 能 ? 其 是 否特异性识 别某种 或者某 些组 蛋 白甲基化位 点 ,从而作 为一种 特 异性 的 “ Histonecode reader ”? 其 是通过什么机制参 与到常染色质 区域基 因 的表达调控 的 ? 这些 问题 一直没有得 到解 决 。 另外 多年来 组蛋 白赖 氨酸 的 甲基化 一直 是人们研 究 的热点 ,因为组 蛋 白赖氨酸 甲基化在生物体 中发挥 着重要 的作用 ,比如调节基 因表达 ,调 节 染色质 折 叠状态等 ,大量 的赖氨酸 识别 子 己经 得 到发现 。而 组 蛋 白精氨酸 甲基化在 生物 体 中发挥 着 同等 重要 的作 用 , 那 么对其 识别子 的寻找 也就 具有 同等重要 的地位 。因此本课题采用人工合成 的组 蛋 白多肤筛选 PHDuoF, 结构域特异性识别 的 甲基 化修 饰 位 点 以及 不 同的 甲基 化 修 饰 状 态 。并 采 用 等 温 滴 定量 热 法 (Is otherm alti trati on calori m etry ,ITc) 以及 复 合 物 晶体 实 验 进 一 步 检 测 确 定 组 蛋 白多 肤 与PHDu n RF , 结构域 的特 异性相 互作用 。 材料与方法一质粒 : petZsa,p6 〔 x一 4下i 来 自本 实验 室实验材料菌株 : T0 p10,sLZi(o 臼)来 自本 实验 室限制性 内切酶部分购 自 takara 公 司 (中国,大连 ),部分购 自 N EB 公司o NA 聚合 酶 (pri m e巧 tar) 购 自 takara 公 司T4 连 接酶 购 自 takara 公 司质粒抽提 试剂盒 ,购 自 Ax ygen 公 司pcR 产物 回收试剂盒 ,购 自 Axygen 公司。 NA 割胶 回收试剂盒购 自 Axygen 公司N i 一 NTA beads 购 自 G E 公司G l utathi one sePharose4B 购 自 G E 公司streptavi di n agarose 购 自 m i l l i pore 公 司棺 ; 棺L105910 H 二. 常用试剂1.LB 液体 培 养基蛋 白陈酵 母提取 物N a C IddH ZO 至121oC高压 灭 菌 20m in2.IM IPTG 诱导剂I P T G 2 . 4 9ddH ZO 至IOm l0.22 p m 滤 头过滤 后 分装 冻 存 于 一 20 ℃3.5枷g加 l 卡那霉 素卡那 霉 素SO0mgddH ZO 至IOm l0.22 “m 滤 头 过滤 后 分装 冻 存 于一 20 ℃ 4.100mg/m1 氨节青霉素氨 节青霉素ddHZO 至0.22 p m 滤头过 滤后分装冻存 于一 20 ℃5 0 0 】 z 〕 M E D T AE D T A 一 N a Zd dH Z O用 IM NaOH 调 PH 到 8.0 ,定容至 100m l1g10 m l2 0 9S O m l5 . 5 0XT A ETris 碱d d H Z O冰 乙酸EDTA (0.SM)定容至 儿2 4 2 96 0 0 m l5 7 . lm lIO 0 m l6 . IMD T T二硫 苏糖 醇0.OIM 乙酸钠 溶 液 (PH 5.2)0.22 p m 滤头过滤后 分装冻存 于一 20 ℃7 . IMT r is( PH 7 .4 )Tr is 碱d dH 2 0盐 酸 调 PH 到ddHZO 定容 到121 ℃高压灭 菌 20mi n 可长 期保存 。3 . 0 9 9Z O m l12 1 . 14 98 0 Om l7 . 41L8 . IMT r i s( P H 6 .8 )Tr 15 碱d d H Z O盐 酸调 PH 到ddHZO 定 容 到121 ℃高 压灭 菌 ZOmi n 可 长 期 保存 。12 1 . 14 98 0 0 m l6 . 8 ,I L 。 9. p 一 琉 基 乙醇 : 商 用 的为 14.4M ,贮 存 于棕 色瓶 中保 存于 4℃ 。10 . 1. SM T r i sTris 碱d d H Z O ,盐 酸 调 PH 到ddHZO 定容 到121 ℃高压灭 菌( PHS .8 )18 1. 6 9S O Om l8 . 8lL20m in 可长期 保存 。1 1. 10 %S D SS D Sd dH Z O加 热 溶解4 0 94 0 0 m l12.10%过硫 酸按过硫 酸按d dH Z O1g10 m l13.5 XTri s一 甘氨酸 电泳缓冲 液Tr 15 碱甘氨酸10% S D SddHZO 定容至15 . 199 4 95 0 m l儿14.SDS一 PAGE 染 色 液甲醇 : 水 (1:1)冰 乙酸考马斯亮蓝g o m lIO m l0 . 2 5 915.Z X SD S- - PAGE 上样 缓冲 液T r i s一 H C I( PH 6 .8 )甘油S D S澳酚 蓝IO 0 n侧2 0%4% (W/V)1% (W/V) 用 前加 10% p 一 疏 基 乙醇16.30%丙烯 酞胺凝胶贮存 液丙烯 酞胺N, N一 甲叉双 丙 烯酞胺d d H Z O37℃完 全溶解 ,补加 水 到0.45 p m 滤 头过滤后 贮存 于 4℃ 。2 9 91 g4 Om lIO 0m l17. 505一 PAG E 胶一 溶液TriS一 HCI (PHS.8)S D SB(4 X Bu f fer )1 . ...

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